蔡司顯微鏡和艾克發生物將聯合提供解決方案
近些年，腫瘤免疫微環境(TiME)成為腫瘤研究領域的一個熱門的話題，也吸引了大批研究人員的注意力。一篇又一篇文獻在期刊上不斷發表，人類對于腫瘤發生、發展、轉移、復發等的認識也不斷加深。在眾多相關文獻中，我們經常可以看到一張張絢麗的多重免疫組化(mIHC)的圖像。
為什么這么多研究人員都選擇mIHC技術呢?主要是因為腫瘤免疫微環境的復雜性和多樣性，為了更好的了解不同類型細胞的分布和相互關系，需要同時對多種生物標志物進行標記。
但是在實際實驗中，mIHC 卻讓人很頭疼。如何選擇抗體、如何進行標記、如何進行染料搭配等等問題讓實驗變得耗時耗力，結果還往往不理想。
如何將 mIHC 從科研的攔路虎變成高分文獻的助推器?這需要技術層面提供更全面的解決方案和數據分析能力。下面我們會以非小細胞肺癌樣本的染色為例，為大家展示如何利用該技術進行腫瘤免疫微環境的研究。
我們將非小細胞肺癌樣本的11個常見腫瘤免疫相關生物標志物進行了染色標記和全切片成像。
(photo by ZEISS Axioscan7, 該設備可對腫瘤免疫微環境研究中的多色熒光標記切片進行更高效率、更高質量的成像。)
11-plex的多靶點免疫組化結果可獲取211種表型信息，根據不同的實驗設計和研究方向如免疫細胞分型、三級淋巴結構、腫瘤相關巨噬細胞等，可以組成不同Panel組合分別進行分析。下面是一些常見的研究方向對應的組合信息。
免疫細胞分型研究
免疫細胞分型研究包括了CD3，CD4，CD8，CD45RO，PANCK，共計5個生物標記物(見圖3)。PANCK(綠色)標記腫瘤細胞，其余可精準分型T細胞(CD3+)、輔助T細胞(CD3+CD4+)、細胞毒性T細胞(CD3+CD8+)、記憶輔助T細胞(CD3+CD4+CD45RO+)和記憶細胞毒性T細胞(CD3+CD8+CD45RO+)。
三級淋巴結構研究
三級淋巴結構(TLSs)是存在于腫瘤或很多炎癥部位周圍的異位淋巴結構，其結構和功能與次級淋巴器官相似，是TiME中抗腫瘤免疫應答啟動的直接部位，對患者的生存預后、治療反應及免疫治療應答評估都有積極的作用。TLSs的組成一般包括B細胞、T細胞、濾泡樹突狀細胞、漿細胞、成纖維網狀細胞、中性粒細胞、腫瘤相關巨噬細胞等[1]。
三級淋巴結構研究包括了CD3，CD20，KI67，PANCK，共計4個生物標記物(見圖4)。PANCK(綠色)標記腫瘤細胞，其余可精準分型T細胞(CD3+)和B細胞(CD20+)，KI67可觀察各細胞的增殖情況。
對CD3+細胞進行熱圖分析，結果見圖5，圖中紅色是CD3+細胞表達豐度高的區域，黃色到綠色是表達豐度下降的區域。
對結果進行空間近鄰分析，以PANCK為中心，可得到CD3+細胞與PANCK+細胞的平均距離為37.40 μm(結果見圖6)。
腫瘤浸潤淋巴細胞研究
腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)研究包括了CD3，TIM3，PD-L1，CD68，PANCK，共計5個生物標記物(見圖7)。PANCK(綠色)標記腫瘤細胞;分別統計腫瘤和間質區域內的CD8+細胞(紅色)的百分比，確認浸潤程度;TIM3標記腫瘤浸潤CD8+T細胞功能失調的亞群，可作為實體瘤的預后標志物;PD-L1表達情況確認是否采用該靶點進行免疫治療;同時可對巨噬細胞(CD68+)和腫瘤相關巨噬細胞(CD68+PD-L1+)進行數量、密度和百分比的統計分析。
進行浸潤分析(見圖8)，劃分腫瘤和間質邊界(圖中黃線)，以100 μm的閾值分別向腫瘤中心和間質區域進行浸潤分析，統計不同浸潤區域內CD8+細胞的數量、密度和百分比(見表1)。
腫瘤相關巨噬細胞研究
巨噬細胞研究包括了CD68，CD163，PD-L1，PANCK，共計4個生物標記物(見圖9)。PANCK(綠色)標記腫瘤細胞;CD68標記M1型巨噬細胞，CD163標記M2型巨噬細胞;PD-L1+CD163+標記腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)。
上面是我們列舉的12色多重免疫組化染色中的部分研究Panel。除此以外，還可以根據不同的實驗需求組成更多不同的組合。看完上面的實際案例，您是否也有興趣設計自己的染色方案，窺探腫瘤免疫微環境奧秘?蔡司顯微鏡和艾克發生物將聯合為您提供從染色標記到掃描成像，再到數據分析的整套解決方案。
